Raquel Boronat Gil y José Pedro López Pérez

Una visión cercana de la Microscopía en el Laboratorio de Educación Secundaria

¿Cómo manejar el Microscopio Óptico

Es fundamental que el alumno de biología adquiera las competencias necesarias para utilizar este equipo tan universal de laboratorio y que su uso, con el paso del tiempo, no genere perjuicios en el instrumental óptico. Las principales normas a seguir para el correcto uso se describen a continuación:

1. Si el microscopio se encuentra localizado en la mesa de trabajo del alumno, lo primero será quitar la funda protectora. Si el alumno debe portearlo desde el lugar de reserva hasta la mesa de trabajo, el microscopio debe cogerse, con firmeza, desde su brazo o columna.
2. Se enciende/enchufa el microscopio a la corriente eléctrica y se regula al máximo la intensidad de luz.
3. Con la ayuda del tornillo macrométrico, se baja la platina hasta el tope fin de giro.
4. El objetivo de menor aumento (4x), caracterizado por su pequeño tamaño y una línea roja, debe localizarse perpendicular a la platina. Por lo tanto, se gira el revólver hasta localizarlo en esta posición.
5. Se coloca el portaobjetos en la platina, se fija con las pinzas y se localiza la muestra sobre el orificio de entrada de luz.
6. A continuación se procederá con el enfoque de la muestra. Para ello, observando la preparación a través de la lente ocular, y girando el tornillo macrométrico lentamente, debemos percibir correctamente la preparación a bajo aumento. Este paso es el más importante del proceso, generando la máxima expectación en el discente, por lo que se recomienda al docente revise todos los enfoques generados en los microscopios que haya en ese momento en el aula.
7. Los sistemas ópticos actuales disponen de lentes parafocales; es decir, el cambio de lente tras el giro del revólver no implica modificación del enfoque de la preparación. De este modo, podemos pasar a 10x y 40x, modificando brevemente el enfoque con el giro del tornillo micrométrico.
8. Si se dispone de objetivo de inmersión 100x, previo a observar a través del mismo, se adicionará una gota de aceite de inmersión sobre el portaobjetos para, finalmente, modificar el enfoque con el micrométrico. Se recomienda en este caso pasar directamente de la lente objetivo 4x a la lente 100x, evitándose que el resto de lentes pudieran tocar el aceite de inmersión. La lente que suele sufrir mucho el uso de este reactivo debe limpiarse al finalizar la experiencia, evitándose que los restos de aceite pudieran dañar o quedar incrustados en el objetivo. Se recomienda la limpieza mediante el frote de la lente con una gasa suave que porta unas gotas de xileno.
9. Para sustraer el portaobjetos tras el análisis de la preparación, se cambiará con ayuda del revólver al objetivo de 4x y bajará la platina con ayuda del tornillo macrométrico.
10. Como anotación final del proceso de observación de la preparación biológica, se recomienda el uso del diafragma para modificar la entrada de luz, con el consiguiente aumento del contraste de la muestra.

El contraste en la microscopía óptica rutinaria

El contraste es necesario cuando la resolución y la observación distintiva de los objetos presentes en la preparación se hacen muy difíciles. Un cuerpo tendrá mucho contraste cuando su índice de refracción sea muy diferente al índice de refracción del medio en el que está sumergido. Por ejemplo, las células tienen índices de refracción parecidos al agua, ya que un 75% de su composición química está definida por esta molécula. Este hecho permite que los rayos de luz que atraviesen la muestra no retarden la fase de luz, frente a aquellos que lo hacen en el medio acuoso. Por tanto, cuando se unan al final del proceso de observación, no nos darán un buen contrastado de la muestra ya que ambas fases son iguales.

Por el contrario, cuando las estructuras biológicas tienen un índice de refracción diferente al agua su contraste será mayor. Las partes coloreadas de algunos microorganismos, tales como las presentes en las algas microscópicas, tendrán mejor contrastado (Figura 9) frente a aquellos que carecen de las mismas.

El contrastado de estructuras biológicas fue un desafío constante durante el siglo XIX tras el avance de la óptica del microscopio. La preocupación acabó con la utilización del color, es decir, el uso de las tinciones.

En este trabajo se han utilizado los siguientes colorantes de contraste, fáciles de conseguir y muy necesarios en un laboratorio de enseñanza media:

• Disolución al 0.5% de Azul de metileno. Se disuelven 0,5 g de colorante polvo en 100 ml de agua destilada. Se aconseja filtrar la disolución resultante para eliminar los precipitados de colorante.
• Disolución al 0,5% de Violeta de genciana. Se disuelven 0,5 g de colorante polvo en 100 ml de agua destilada.
• Solución comercial de Povidona yodada, sustitutivo muy barato del reactivo de Lugol (2 g de yodo molecular y 4 g de yoduro potásico en 100 ml de agua destilada. Tras la agitación vigorosa es preferible filtrar la preparación para eliminar los restos de reactivos precipitados).

No obstante, en la gran mayoría de las preparaciones se ha trabajado con el diafragma iris del microscopio, cerrándolo o abriéndolo, permitiendo un paso controlado de luz que aumente el contraste de las preparaciones. En otros casos, con la ayuda de un disco de cartulina oscura, se ha tapado parcialmente la fuente de iluminación, permitiendo la salida de un haz de luz periférico al mismo, aumentando el contraste de la muestra (microscopía de campo oscuro).

Figura 9. Imagen al microscopio de campo claro, sin tinción de la preparación, de material mucilaginoso de un biofilm creado en el acuario del centro de estudios. Se denota el elevado contraste que presentan los microorganismos (algas clorófitos) frente a aquellos que carecen de pigmentos fotosintéticos. Objetivo 40x.